NGS项目四：高通量测序在植物生物胁迫研究中的应用

在植物生物胁迫研究方面，本文通过作者所精密相关课题组的研究，比较传统研究方法和高通量测序方法的优劣。

Sun X, Tan Q, Nie Z,et al. Differential Expression of Proteins in Response to MolybdenumDeficiency in Winter Wheat Leaves Under Low-Temperature Stress[J].Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32(5):1057-1069.

讨论：
本研究揭示了在正常和寒冷条件下冬小麦钼缺乏所造成蛋白组的改变。我们鉴定了13个钼调节蛋白位点，5个参与到光合作用光反应，5个参与到光合作用暗反应，3个高度参与到RNA结合和蛋白合成。
钼在低温胁迫下参与光反应
这5个参与光合作用光反应的蛋白位点被鉴定为cytochromeb6-f铁—硫亚基。蛋白可能存在于超过一个的位点，可能是因为翻译后转移，例如磷酸化影响蛋白的pI值。在光合作用的光反应阶段，cytochromeb6-f复合物的功能师调节电子在两个光合作用反应中心复合体间的转移，从PSII到PSI.我们推测钼调节cytochromeb6-f磷酸化复合铁-硫亚基然后调节在低温下的光反应中的电子转运。同时b6-f复合体表现出参与到叶绿素合成。B5,一个光捕获叶绿体a/b结合蛋白，是在植物中丰度最大的叶绿体蛋白。它的主要功能师收集和转运光能到光反应中心。几个研究推测，光捕获叶绿体a/b-结合蛋白解压在胁迫条件下，如冷害、高度盐质、干旱时下调，并产生甲醛.在低温胁迫前，叶绿体a/b-结合蛋白在施钼和缺钼组间没有显著的差别。……这些结果暗示钼可能在保持光捕获叶绿体a/b结合蛋白稳定性中起作用。叶绿体a/b结合蛋白和色素含量相对降低可能降低叶片捕获光的能力，特别是低温胁迫后。同时，光合a/b比例在钼缺乏叶片中增加，这可能因为抑制了叶绿素a到叶绿素b的转化，这最有可能改变光捕获能力。推测缺钼可能降低ABA和IAA含量并影响小麦的耐冷性。上述两种蛋白的改变部分原因是AQY和Pmax在施钼处理时较高。
钼在低温胁迫下参与暗反应
在这个试验中，5个蛋白位点参与到暗反应中卡尔文循环。RuBisCO大小亚基可以增加RuBisCO的火星继而调节光和速率。A2,chloroplasticFBA，激活碳代谢中几种重要的反应。最近，它被报道参与到冷胁迫中。过表达FBA刺激核酮糖1,5二磷酸regeneration并促进CO2固定。钼施用增加了冷胁迫前后FBAd的表达量，这可能增强了小麦中潜在的碳固定。phosphoglyceratekinase,刺激了3-phosphoglycerate从1，3-bisphosphoglycerate通过卡尔文循环，和glycolysis途径。冷胁迫48h,钼的使用引起phosphoglycerate激酶超过3倍的增加。CE可以部分反应暗反应阶段碳固定效率。在施钼后，冷胁迫并不使B1,B2和B8的表达量降低，这部分解释了施钼冷处理48hCE和Pmax有较大的提高。
钼参与到RNA结合和蛋白合成
钼的施用可以增加可溶性蛋白，缺钼时，低含量的5-methylcytosine可能扰乱DNA的复制和转录，继而影响蛋白的合成。在本试验中，3种蛋白与RNA结合和蛋白合成高度相关。cp31BHv可能在低温下贡献蛋白合成和组装。B4作为真核initiation因子，是dynamic可能收环境信号的影响。B9是ribosomal蛋白P1,是真核生物生物合成中十分丰富。在缺钼时，低温抑制了它的合成。结合B1、B2、B3、B5和B8的变化说明钼可能参与到蛋白的合成（稳定性的维持）。

Lu X, Kim H, ZhongS, et al. De novo transcriptome assembly for rudimentary leaves inLitchi chinesis Sonn. and identification of differentially expressedgenes in response to Reactive Oxygen Species.[J]. Bmc Genomics,
2014,15(1):232-233.

研究背景：转录数据呈现荔枝叶片ESTs，这对于未来研究荔枝基因组和其他紧密相关的种类是重要资源。提供了潜，在花座中基本叶控制过程中，成花的候选基因用于功能分析。
荔枝树属热带、亚热带广泛种植的常绿木本树。在全球变暖、气候变化时导致的开花缺陷对于荔枝生产是主要挑战。以前的研究已经表明，高温条件可促进花蕾中早期叶的生长而且抑制荔枝开花，而甲基紫精二氯化物（MV）诱导的活性氧可以促进早期叶的衰老、脱落。为了解活性氧在荔枝开花过程中的分子功能，对荔枝进行了转录组测序并从头进行组装。
研究拟南芥和其他植物暗示LFY(LEAFY)是决定花分裂的转录因子，在花芽中强烈表达。紧接着的AP1(APETLA1）的表达叶表现出提高柑橘的开花。
虽然荔枝果实的转录数据已经被发表，叶片的缺未知。我们叶用数字基因表达来分析ROS处理后转录组的动态，一评估ROS诱导的败育的遗传网络。
讨论：
胁迫诱导常绿灌木果树开花。ROS起到胁迫信号的角色并被认为在广泛的过程中起到重要的信号作用。它们在光下在叶绿体和过氧化物酶体中生成，在黑暗条件下在，在线粒体和非绿色组织中生产。我们先前研究表明ROS由MV诱导，促进荔枝，叶片穗原基发育和叶穗败育。

数据处理时首先要拼接得到参考转录组。进行GO注释——进行KEGG注释（28.6%(1,494/5,223)的DEGs能够被注释.

DEGs注释到的最有代表性的前10个KEGG代谢途径于表4中列出）——为查看5223个DEGs的表达趋势,0h到10h的活性氧处理表达量数据归一化为0,log2
(υ5h/υ0h), log2 (υ10h/υ0h). 用STEM软件将所有DEGs趋势分为8类——与活性氧反应信号转导通路相关差异表达基因分析——KEGG中与植物激素信号传导通路相关的差异表达基因的表达量热图绘制——差异表达基因的qRT-PCR与RNA-seq的表达比较——定量RT-PCR和RNA-seq之间的倍数变化的数据系数分析。
从头组装和注释
TrinityProgram从头组装——BLASTxprogram来注释——nrdatabase/Swiss-Prot/KEGG/COG来发现unigene——GO注释用Blast2GO软件——Functionalclassification用WEGO软件——KEGGpathway
annotation用Blastall软件——转录组注释SOAPaligner/soap2软件——DEGsclustered用STEM

总结：高通量所需材料较少但比较考究。可以说重点是数据的解析，这些数据相当于很多次定量PCR的叠加，虽然价格昂贵（一般是该领域的专家在大型基金的支持下做的），但收获也很大。包括下游验证试验，针对性的回答一些问题，学术价值较高。