RNA-seq 流程、问题总结（一）

这是2012 年的3月份的一篇nature protocol
，下面是我作为一个RNA-seq 方面的菜鸟在根据这个protocol 跑流程时遇到的问题及解决的方法，现总结如下：

一、果蝇全基因组下载Fruit fly iGenome packages (Ensembl build; download via the TopHat and Cufflinks websites, along with packages for many other organisms; ）

注意：Drosophila_melanogaster\Ensembl\BDGP5.25下面有三个文件夹 分别是 Annotation、GenomeStudio、Sequence 其中Annotation/Genes/genes.gtf中是注释文件 ，在

Sequence/BowtieIndex/genome.*是用Bowtie 建好的索引文件，以ebwt 结尾的文件，如果没有，就要自己用bowtie -build 命令来建立索引文件。

二、Downloading sequencing data：Raw sequencing reads, aligned reads, assembled transfrags and differential analysis are all available through the
Gene Expression Omnibus at accession GSE32038.

GEO 数据库的有关介绍：Gene Expression Omnibus（GEO）数据库

三、软件的下载安装，这里的软件大都可以直接下载解压后，把其中的文件copy 到bin 目录就好了，当然你也可以选择自己重新编译，但是会遇到各种问题（我没尝试过），Tophat 下载地址，cufflinks下载地址，例如cufflinks 下载解压后 把下面这四个文件copy
到bin目录下 。



四、Map the reads for each sample to the reference genome



说明： 1、这几条命令中每条包含三个文件，gtf 文件，索引文件，和sequence（.fq） 文件

2、这里的genome 就是上面说的Bowtie建立的索引文件

3、tophat参数详解

4、最后三条命令出错啦，用绿色把1改成2的部分

5、每个文件的路径，如果不确定的话就用绝对路径，这里的这种写法是这三个文件在同一个目录下

五、



六、



七、



这一步容易输出警告。

八、



这一步也容易出现问题，在SEQanswers上有详细解答，详见TopHat protocol error at cuffdiff。